Maladie de Charcot-Marie-Tooth : création de modèles cellulaires neuronaux via les technologies hiPSCs et CRISPR-Cas9 et test de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Discipline

Biologie Chimie Santé mention Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Classification

Sciences de la vie, biologie, biochimie

Mots-clés libres

Charcot-Marie-Tooth, HiPSCs, CRISPR-Cas9, Mutation non-Sens, Molécule de translecture, Sh3tc2

Mots-clés

Maladie de Charcot-Marie-Tooth,

CRISPR-Cas9

La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) est la neuropathie périphérique héréditaire la plus fréquente chez l’humain. Elle touche les motoneurones (MN) et les cellules de Schwann (CS). La majorité des gènes impliqués, dont SH3TC2 et GDAP1, peuvent être affectés par des mutations non-sens. En 2021, peu de modèles cellulaires humains existaient, et aucun traitement curatif n'était disponible pour les patients. Les travaux de cette thèse se centre sur SH3TC2, responsable de la forme démyélinisante autosomique récessive la plus fréquente des CMT, nommée CMT4C ou AR-CMTde-SH3TC2 et sur GDAP1 notamment responsable d’une forme axonale AR-CMTax-GDAP1. Dans un premier temps, nous avons analysé une cohorte de 103 patients mutés sur SH3TC2 et montré que plus de 80 % des patients possédaient au moins un allèle avec une mutation non-sens, associé à une gravité clinique accrue. Nous avons également identifié 22 nouvelles mutations pathogènes sur ce gène. La seconde partie de ce travail a consisté à créer les premiers modèles cellulaires neuronaux humains pour SH3TC2. À partir de cellules souches pluripotentes induites (hiPSCs) issues d’un individu contrôle, nous avons utilisé la technologie CRISPR-Cas9 pour produire, avec plus de 90% d’efficacité, deux modèles humains in vitro contenant des mutations non-sens induisant un codon stop prématuré (PTC) : un modèle homozygote p.(Arg954*) (PTC de type UGA) et un modèle homozygote p.(Gln71*) (PTC de type UAG). Ces hiPSCs contrôle et mutées ont ensuite été différenciées en CS. Nous avons mis en évidence une expression précoce de SH3TC2 dans les CS contrôle. Dans les modèles CS AR-CMTde-SH3TC2, une expression réduite de SH3TC2, un retard de maturation, une capacité réduite à soutenir les MN en coculture, et des anomalies dans le recyclage des récepteurs à la transferrine ont été observées. Enfin, nous avons testé plusieurs molécules thérapeutiques ciblant les mutations non-sens, des agents de translecture et des inhibiteurs du mécanisme de surveillance des ARN non-sens (NMDi). Sur un modèle de progéniteurs neuronaux dérivés d’hiPSCs portant la mutation homozygote non-sens p.(Ser194*) (UGA) sur GDAP1, nous avons testé une de ces molécules et montré qu’elle stabilisait l'ARNm muté GDAP1, restaurait son expression protéique et corrigeait la morphologie mitochondriale. Dans les modèles CS créés dans cette thèse pour SH3TC2, nos premiers résultats suggèrent l’effet positif de deux de ces molécules sur la réexpression de la protéine pour les deux types de codons UGA et UAG. Dans la quatrième partie de ce travail, nous avons développé un modèle 3D de coculture CS/MN permettant d’induire la myélinisation, étape ultime pour étudier les maladies démyélinisantes comme l’AR-CMTde-SH3TC2. Les molécules thérapeutiques identifiées pourront être testées sur ces modèles cellulaires de coculture et potentiellement in vivo pour évaluer leur capacité à induire une remyélinisation. Ce travail de thèse souligne l'importance des modèles cellulaires adaptés pour comprendre les mécanismes physiopathologiques de la CMT et ouvre des perspectives prometteuses pour de nouvelles approches thérapeutiques.