Apport de la spectrométrie de masse et de la biologie moléculaire à l'identification des champignons filamenteux au laboratoire de mycologie médicale

Discipline

Biologie Médicale

Classification

Médecine et santé

Mots-clés

Champignons - Thèses et écrits académiques,

Spectroscopie de masse - Thèses et écrits académiques

L’identification classique des champignons filamenteux repose sur des caractères phénotypiques culturaux macroscopiques et microscopiques. Cette méthode est longue. Elle est limitée par la morphologie similaire d’espèces différentes entraînant des erreurs d’identification ou l’absence de fructification en culture rendant l’identification impossible. De plus, les remaniements taxonomiques sont fréquents, conséquence de l’évolution de la biologie moléculaire. Pourtant il est nécessaire d’identifier au rang de l’espèce les champignons filamenteux. En effet, le nombre d’infections fongiques invasives est en augmentation et il existe des différences de sensibilité aux antifongiques au sein même des espèces. Le séquençage de l’ADN ribosomal reste la méthode d’identification de référence. Une nouvelle technique plus rapide et moins coûteuse tend à s’imposer en microbiologie : la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF. Les spectres obtenus à partir des protéines ribosomiques sont comparés à une banque de spectres. L’efficacité de la spectrométrie repose donc sur la qualité des bases de données. Dans une démarche d’homogénéisation des pratiques de biologie médicale dans le cadre de l’accréditation des laboratoires, nous avons testé 139 champignons filamenteux. L’identification classique a été réalisée à partir de cultures fongiques sur des milieux de Sabouraud. Nous avons utilisé le séquençage des régions ITS 1-2 et de la béta tubuline comme méthode de référence. Nous avons utilisé le Vitek-MS® (Biomérieux®) pour la spectrométrie de masse MALDI-TOF dans ses deux modes de fonctionnement : le mode « recherche » avec la base de données ouverte Saramis® V4.10 et le mode « IVD » avec une base fermée IVD V2.1 actuellement en développement. Avec la méthode classique mycologique, nous avons pu identifier 131 (94,2 %) champignons au rang du genre, et seulement 97 (70 %) au rang de l’espèce. Le séquençage des régions ITS 1-2 et de la béta tubuline a permis d’identifier tous nos champignons. Le Vitek-MS® a permis en mode RUO l’identification de 53 (38,1 %) champignons et de 81 (58,3 %) en mode IVD. Statistiquement, le coefficient Kappa est de 0,85 pour l’examen mycologique classique versus le séquençage, de 0,18 avec la base Saramis V4.10 et de 0,56 avec la base IVD V2.1. Pour les Aspergillus sp., nous obtenons un coefficient Kappa de 0,81 acceptable pour l’utilisation en routine. Mais pour les dermatophytes Kappa est à 0,52, nettement insuffisant. Notre travail montre la nécessité d’améliorer l’identification des champignons filamenteux. La spectrométrie de masse MALDI-TOF, utilisant le Vitek-MS®, est une méthode prometteuse mais elle ne peut pas encore remplacer le séquençage de l’ADN ribosomal. Les insuffisances actuelles de la spectrométrie de masse reposent sur des bases de données beaucoup trop incomplètes. En revanche, le séquençage a sa place au laboratoire de mycologie dans le cas d’identification de champignons filamenteux isolés de prélèvements profonds ou de dermatophytes pléomorphisés. Le séquençage nous a aussi permis l’identification de possibles pathogènes non identifiés par l’étude mycologique microscopique. L’évaluation de la spectrométrie de masse est donc à poursuivre pour les champignons filamenteux, principalement en complétant les bases de données spectrales. C’est à ce prix que la spectrométrie de masse deviendra une méthode performante pour l’identification en routine des champignons filamenteux.